一根漂亮的擴增曲線絕對是他們的心情曲線， 如果突然這根擴增曲線翹尾了， 心情大概就是 小朗最近就收到這樣一名用戶的反饋， 她說在進行PCR實驗時， 擴增曲線翹尾了...... 她的擴增曲線如下圖所示： 那么下面的內(nèi)容絕對值得你收藏! 擴增曲線翹尾是指在實驗結(jié)果中有曲線出現(xiàn)末尾起跳但是沒有完整擴增的現(xiàn)象，導致這個現(xiàn)象出現(xiàn)的原因深究下來主要是2點： 1、目的基因濃度過低，CT值過高，導致曲線后移，這樣就會出現(xiàn)翹尾現(xiàn)象； 2、在反應(yīng)體系中沒有加入模板DNA的情況下，外源污染的核酸進入反應(yīng)體系也會出現(xiàn)翹尾。 如果是第一個原因， 那么給目的基因增加濃度即可。 彌散到實驗室各個角落，比較棘手； 移液器、離心機、核酸提取儀、傳遞窗、PCR儀、拆開的試劑盒、槍頭盒、打開的耗材等表面。 以小編的實踐經(jīng)驗發(fā)現(xiàn)不同來源的核酸污染帶來的風險指數(shù)不同（下圖數(shù)據(jù)僅供參考）。 嚴格的PCR實驗室應(yīng)有標準的正負壓系統(tǒng)及四分區(qū)（或三分區(qū)）， 實驗室應(yīng)按照生物安全二級實驗室及PCR實驗室設(shè)計基本要求來建設(shè)。 可參考的標準為《GB50346-2011建設(shè)標準生物安全實驗室建筑技術(shù)規(guī)范》 及衛(wèi)健委下發(fā)的《醫(yī)療機構(gòu)臨床基因擴增檢驗實驗室工作導則》。 PCR實驗室若不規(guī)范進行分區(qū)，容易發(fā)生氣溶膠污染。 現(xiàn)有技術(shù)指導原則，要求選擇BSL-Ⅱ級生物安全柜。 從臨床經(jīng)驗來看，只有B2型生物安全柜為全排放， 無循環(huán)風，可以用于加核酸模板。不建議A1型、A2型和B1型， 因其循環(huán)風很容易造成核酸氣溶膠的形成，且污染很難清除。 吸取陽性對照（質(zhì)粒）沒有遵循“慢吸快打”的原則（這個需要練習形成“肌肉記憶”）。 新手往往是“快吸快打”，容易造成陽性樣品污染槍頭， 或者在生物安全柜循環(huán)風的影響下，造成氣溶膠飛濺，污染加樣區(qū)域。 應(yīng)使用帶有濾芯的槍頭。 且加完樣的槍頭要丟入含有次氯酸溶液的加蓋垃圾桶中 （因為次氯酸容易揮發(fā)，因此應(yīng)每天都要更換含氯消毒液?。?/p> 《醫(yī)療機構(gòu)臨床基因擴增檢驗實驗室工作導則》指出， 短片段的基因核酸對紫外線損傷不敏感。 常規(guī)消毒劑如酒精、碘化物、戊二醛類、季銨鹽等雖然能殺菌， 但是不能降解核酸，或降解效率較差。 次氯酸鹽類消毒劑可以一定程度降解核酸， 但是腐蝕性強，不能處理精密儀器及金屬制品， 容易腐蝕移液器吸桿影響tip頭氣密性。 紫外線照射12~18小時，但是注意，紫外線有效距離在80cm~100cm之間， 且對200bp以下的短片段核酸不敏感，容易留死角，所以還要同時加強通風。 吸附在儀器設(shè)備等物體表面上的核酸污染處理：使用沒有腐蝕性的核酸清除劑。 例如使用酶解法（耐熱核酸降解酶）的清除劑， 處理移液器、生物安全柜、離心機、傳遞窗等區(qū)域進行噴灑清除。 靜置15分鐘即可。 丟棄3個分區(qū)的所有用過的耗材（主要是tip吸頭和離心管、拆開的試劑盒等）、 非一次性實驗服工作服應(yīng)用次氯酸鹽溶液浸泡1小時后，進行洗滌處理； 盡量使用一次性生物安全Ⅱ級防護服或?qū)嶒灧?/p> 標本進行核酸提取和檢測時應(yīng)盡可能在生物安全柜內(nèi)進行操作。 如為打開標本管蓋或其他有可能產(chǎn)生氣溶膠的操作，則必須在生物安全柜內(nèi)進行。 每天實驗后，使用0.2%含氯消毒劑或75%酒精進行臺面、地面清潔。 除了上面常規(guī)的消毒清潔之外，另外可采用專門的實驗室污染去除儀去除實驗室核酸污染。 樣品臺清潔： 用加液槍加取125ul 75％乙醇溶液或異丙醇至所有孔內(nèi)。使用加液槍對孔內(nèi)溶液進行多次吹洗，移除孔內(nèi)的液體。 再用加液槍加取125ul核酸清除劑至所有孔內(nèi)。使用加液槍對孔內(nèi)溶液進行多次吹洗，移除孔內(nèi)的液體。 使用純凈水進行二次吹洗，移除孔內(nèi)的液體，設(shè)置運行程序 93℃、5分鐘，熱蓋關(guān)閉，使96孔模塊內(nèi)水漬蒸干。 注：若遇見樣品臺孔內(nèi)異物頑固或較多情況，可先用酒精棉拿鑷子清理；再使用加液槍清洗。 儀器表面清潔： 應(yīng)使用0.2%含氯消毒劑或75%酒精進行清潔。 污染，是PCR實驗室出現(xiàn)假陽性、結(jié)果不可信、數(shù)據(jù)不可靠的重要推手。 而且因?qū)嶒炇椅廴竞箅y以清除，導致實驗室廢棄也是屢見不鮮的。 所以，在最初建立PCR實驗室的時候， 應(yīng)考慮最大程度地降低可能出現(xiàn)的PCR污染或杜絕污染的出現(xiàn)， 在實驗室前期設(shè)計及日常實驗室管理和操作中， 就需要進行合理的規(guī)劃以及嚴格執(zhí)行實驗室SOP，把污染的可能性扼殺在搖籃中。
